Nanofilm SEC

　　对于生物疏散而言，生物分子与填料之间的非特异性相互作用往往会导致低的疏散效率，如色谱峰拖尾以及低的接纳率等。Nanofilm SEC填料所接纳的奇特的外貌化学技术可以在硅胶外貌共价键合一层均匀的聚合物链。这种牢固相具有中性和亲水的性质，因此可以最大限度消除填料基质与生物分子，其中尤其是与卵白之间的非特异性相互作用。这种经过特别设计的涂层可以使Nanofilm SEC柱获得高的分辨率和疏散效率。例如，以尿嘧啶作为测试物可以获得高达每米90,000的理论塔板数（见表1）。

　　赛分Nanofilm SEC柱高效疏散的第一个例子见图1。四种卵白质，甲状腺球卵白、BSA二聚体、BSA和溶菌酶，以及一种多肽在Nanofilm SEC柱上获得了满意的疏散。以溶菌酶计获得的理论塔板数高至30,000/m，因此溶菌酶中的一种杂质都可以获得很好的疏散，而这种疏散效果通常只有在高效毛细管电泳中才看获得。SEC柱的尺度测试样品通常为Biorad 尺度卵白（甲状腺球卵白、免疫球卵白G 、卵清卵白、肌球素）。这些卵白质的pI均小于7.5，因此在pH=7.0时不会带有明显的正电荷。但是高度带正电荷的卵白质，如溶菌酶（pI 11.0）、细胞色素（pI 10.6）、抑肽酶（pI 11.0）却容易与填料外貌的残余硅羟基发生强静电相互作用而很是难被洗脱。Nanofilm SEC柱不存在这个问题。而且，赛分公司建设了自己的卵白测试尺度样品，其中就包罗了对生物疏散性能很是敏感的溶菌酶。

图1 在4.6mm I.D.×250mm Nanofilm SEC-150柱上疏散4种卵白和一个多肽。

从图2可以看到，Nanofilm SEC-250柱（4.6mm I.D.×300mm），可以获得牛血清白卵白（BSA）和BSA双聚体的疏散，其中流动相为150mM的磷酸盐缓冲液（pH 7.0）。

　　甲状腺球卵白是一个大分子量卵白（MW 670,000）。商品化的甲状腺球卵白含有聚合体杂质，可能是双聚体或四聚体。从图3可以看到，Nanofilm SEC-500可以对甲状腺球卵白和甲状腺球卵白聚合体实现基线疏散。

图3 用Nanofilm SEC-500柱（5µm, 4.6mm I.D.×300mm）从甲状腺球卵白中疏散出聚合体。

流动相：150mM磷酸盐缓冲液，pH 7.0

流速：0.35mL/min

检测波长：UV 214nm

温度：室温（23°C）

进样体积：5µL

卵白样品：（1）聚合体；（2）甲状腺球卵白（1.0mg/mL），670kD

　　SEC填料孔径的巨细在卵白疏散中起到至关重要的作用。对于在某一特定分子量规模内漫衍的卵白样品而言，Nanofilm SEC牢固相规格的选择需要基于填料的排除极限和线性分子量规模这两个参数。

图4 Nanofilm SEC-150、Nanofilm SEC-250和Nanofilm SEC-500柱（5µm, 7.8mm I.D.×300mm）疏散效果的比力。

流动相：150mM磷酸盐缓冲液，pH 7.0

流速：0.25mL/min

检测波长：UV 280nm

温度：室温（23°C）

进样体积：5µL

样品：（1） 甲状腺球卵白（1.0mg/mL）， 670kD；（2）BSA （1.0mg/mL），66kD；（3）核糖核酸酶A（1.0mg/mL），13.7kD；（4） 尿嘧啶（2.5mg/mL），120 D

图4为具有差异孔径的Nanofilm SEC柱对分子量在120-670,000之间漫衍的三种卵白的疏散，从中可以看到Nanofilm SEC填料孔径的差异对疏散的影响。

　　Nanofilm SEC填料是在硅胶外貌最大限度地共价键合一层亲水的中性薄膜。卵白或其它生物分子与这种填料的相互作用很是小。因此，卵白在硅胶外貌的吸附将会被抑制，这就保证了高的接纳率，并可使卵白在疏散之后依然有着高的生物活性。表2是实验测得的酸性卵白BSA和碱性卵白溶菌酶的接纳率数据。

　　Nanofilm SEC牢固相具有致密的涂层键合密度，因此可阻止任意分子破坏硅胶与牢固相之间的键合，从而保证填料具有高的稳定性。Nanofilm SEC牢固相可用于多种缓冲液中，如醋酸铵、磷酸盐、Tris等。当用150和100mM的磷酸缓冲液（pH7.0）作为流动相时，在3个月或进样1000次后Nanofilm SEC柱的性能仅会发生轻微的改变，保留时间的偏差在5%以内。图5是Nanofilm SEC-150在1、5和10天，每天运行10小时获得的结果。从图中可以看到流出曲线基本重合。图6是两周内卵白和一个小分子在500倍柱体积内保留时间的变化情况。从图中可以看到保留时间变化的差异很是小。 Nanofilm SEC牢固相可在高盐浓度，如1.0M下使用。另外，Nanofilm SEC柱在有机溶剂如甲醇、乙醇、THF、DMF、DMSO等中，以及其与水的混和溶液中也相当稳定。 Nanofilm SEC柱在pH 2-8.5规模内稳定。另外，在短时间内也可以耐受高的pH，如pH 8.5-10。 Nanofilm SEC柱在温度耐受方面体现突出。最高事情温度可到达80°C。

图5 Nanofilm SEC牢固相稳定性实验结果

色谱柱：Nanofilm SEC-150（5µm, 4.6mm I.D.×300mm）

流动相：150mM和100mM磷酸盐缓冲液, pH 7.0

流速：0.35mL/min

温度：室温

进样体积：10µL

样品：1. 甲状腺球卵白（1.0mg/mL）；2. BSA （1.0mg/mL）；3. 核糖核酸酶A（1.0mg/mL）；4. 尿嘧啶（50mg/mL）。每天运行10小时

图6 三种卵白和尿嘧啶在500倍柱体积内重复进样获得的保留时间的变化情况。测试条件同上图。

　　对于SEC而言，填料孔径的巨细决定了所能疏散的分子量规模，而孔体积则决定了疏散容量。Nanofilm填料拥有4种孔径规格，可以笼罩一个宽规模分子量漫衍的生物大分子。图7是Nanofilm SEC-150、Nanofilm SEC-250和Nanofilm SEC-500的卵白分子量校正曲线。

图7 Nanofilm SEC牢固相稳定性实验结果

色谱柱：4.6mm I.D.´300mm, 填料粒径为5µm

流动相：150mM磷酸盐缓冲液, pH 7.0

流速：0.25mL/min

检测波长：214nm

进样体积：5µL

样品：1. 甲状腺球状卵白（670kD）, 2. IgG（150kD）, 3. BSA双聚体（132kD）, 4. BSA （66kD）, 5. 卵清卵白（44kD）, 6. 肌红卵白（17.6kD）, 7. 溶菌酶（14.3kD）, 8. B12 （1.35kD）, 9. 尿嘧啶（120D）

另一种广泛使用的表征SEC牢固相的要领是以卵白的分子量对扩散系数（Kd）作图。Kd按下式界说： Kd = （Ve-Vo）/（VT-Vo） 其中Ve、VT和Vo划分是样品洗脱体积，色谱柱的总体积和柱的死体积。卵白分子量和Kd的线性区间经常会被作为SEC牢固相选择的参考。如图8所示，Nanofilm SEC-150在一个宽的分子量规模内分子量和Kd之间有着良好的线性关系。

图8 Nanofilm SEC-150的卵白分子量校正曲线

色谱柱：Nanofilm SEC-150 （4.6mm I.D.×150mm, 5µm）

流动相：100mM磷酸缓冲液，pH 7.0

流速：0.25mL/min

检测波长：UV 214nm

温度：室温（23°C）

进样体积：5µL

样品：（1） 甲状腺球卵白（670KD）；（2） IgG（150KD）；（3）BSA双聚体（132KD）；（4 ）BSA（66KD）；（5）卵清卵白（44KD）；（6）a-胰凝乳卵白酶（25KD）；（7）肌红卵白（17.6kD）；（8）溶菌酶（14.3kD）；（9）多肽样品（1.5kD）；（10）尿嘧啶（120D）

　　对于带正电荷卵白的疏散，往往需要用高盐浓度来削弱硅胶基质与卵白之间的强静电相互作用。好比细胞色素C是一种富含正电荷的卵白质（pI=9.6），因此很难在低盐浓度（好比50mM磷酸盐缓冲液， pH 7.0）下被洗脱出来。使用高盐浓度洗脱会限制SEC柱在卵白疏散中的应用。赛分公司所开发的Nanofilm SEC柱可以有效地疏散带正电荷的卵白质。如图9所示，接纳Nanofilm SEC-500柱，细胞色素C可以在50mM磷酸盐缓冲液（pH 7.0）中获得很好的疏散，而这种疏散效果是其它硅胶基质SEC柱所无法实现的。Nanofilm SEC柱的泛起为SEC开拓了许多新的应用领域，例如疏散对盐敏感的生物分子，卵白相互作用的研究，以及LC/MS检测等。

图9 细胞色素C在差异磷酸盐缓冲液（pH 7.0）中的流出曲线

色谱柱：Nanofilm SEC-250柱（5µm, 4.6mm I.D.×300mm）

流速：0.35mL/min

检测波长：UV 214nm

温度：室温（23°C）

进样体积：5µL

样品浓度：1.0mg/mL

　　与Nanofilm SEC相比，SRT SEC具有更高的疏散容量和分辨率，可供选择的孔径规格也要比前者多。但是，Nanofilm SEC在一些应用，如使用低盐浓度或含可挥发性盐的有机溶剂作为流动相进行富含正电荷生物分子的疏散，多维色谱疏散，以及LC/MS等中体现得更为稳定，而这是传统SEC牢固相所无法实现的。另外，SRT和Nanofilm SEC牢固相也具有差异的选择性。SRT和Nanofilm SEC牢固相可以组合起来使用，从而可为生物分子，水溶性聚合物，病毒和细菌，以及纳米颗粒等的疏散提供一个完整的疏散方案。