重组胶原卵白纯化秘籍：差异表达体系的纯化工艺焦点与FAQ解析
胶原卵白是哺乳动物细胞中最主要的卵白身分，占全身总卵白的30%左右，其广泛存在于皮肤、骨骼、肌腱和韧带中，主要提供机体的强度、支撑、修复和连接作用。结构完整的胶原卵白是由三条氨基酸链相互缠绕形成，也决定了其生物学活性。胶原卵白市场火热，重组胶原卵白以其来源稳定宁静，产物纯度高结构可控且不具备病原体风险等优点，受到各胶原卵白生产厂家的青睐。重组胶原卵白是通过将人类胶原卵白的某功效区的基因片段插入微生物或动物细胞中重组表达，通过大规模发酵后疏散提纯而得。PA团体官方网站总结实际应用经验，整理了重组胶原卵白下游纯化工艺及常见问题解析。
重组胶原卵白下游纯化工艺
生物大分子重组表达后一般需要经过下游疏散提纯才气获得高纯度高质量的产物，整个历程主要依赖的是目标产物和杂质之间的性质差异来进行疏散，重组胶原卵白的杂质主要分为以下几个类型：HCP（宿主残留卵白）、降解片段、内毒素、色素等。由于胶原卵白应用主要在医美领域，产物附加值相较于生物大分子药偏低，因此其对于成本控制要求较高。为此，PA团体官方网站推出了一系列高性价比的胶原卵白纯化解决方案。
图1. 重组胶原卵白纯化基本流程
胶原卵白常见表达体系有酵母体系和大肠杆菌体系，由于市场近期对全长胶原卵白回馈比力好，因此有部门企业也使用哺乳动物细胞表达全长的胶原卵白。表达体系差异，杂质体现也有差异情况的差异性。
酵母表达体系
由于酵母体系多为排泄型表达，因此发酵液纯度相对较高，经过前处置惩罚基本可以维持至60%~80%的纯度水平。市面上常见的胶原卵白类型主要有I型、III型和V型，这三类胶原卵白的实际pI一般都大于7，同时pa团体中国发现，毕赤酵母HCP的pI多泛起酸性，因此可利用其带电性的差异，使用阳离子交流层析进行捕捉疏散，阳离子交流层析载量高，价钱自制，是放大生产的不错选择。另外胶原卵白由于长链结构的特殊性，而且重组表达大多不具备三级结构，多泛起单链状态，样品的稳定性一般，因此许多样品都有差异水平的降解碎片，且有些降解碎片和目标物相差很�。鲇醚衾胱咏涣骱苣训酱锝虾玫氖枭�。通过实验验证pa团体中国得出疏水层析对目标物和片段有不错的疏散度，而且胶原卵白的一级结构通�：幸恍歉彼�、羟赖氨酸，所以胶原卵白的亲水性相较于HCP的亲水性更强。综上所述，对于发酵液纯度高且降解片段少的样品，推荐接纳阳离子交流层析的模式去捕捉纯化；对于发酵液纯化低且降解片段又比力高的样品，推荐接纳阳离子复合疏水层析（MMC）去做第一步的捕捉层析。若一步层析比力难到达要求，可增加一步疏水层析做为精纯步骤。
推荐填料：
阳离子交流层析：Agarosix-SP Excel，Monomix HC60-SP
复合阳离子交流层析：Agarosix MC75/45-MMC
疏水层析：Generik MC60/30-HIC Butyl，Polar MC60/30-HIC Phenyl
大肠杆菌表达体系
对于大肠杆菌的胞内可溶性表达样品，经过破胞和澄清过滤后HCP水平依然较高，因此大多数都市在分子构建阶段加入组氨酸标签利用His-tag亲和层析做为第一步捕捉纯化。但由于胶原卵白通�：薪到馄危矣幸徊棵沤到馄我廊缓蠬is-tag。因此通过Ni亲和层析后纯度依然不能大于95%，需要增加一步层析做为精纯步骤。精纯步骤可选取阳离子交流层析或者疏水层析作考虑。若没有标签可参考酵母体系的纯化工艺。
推荐填料：
Ni亲和：Agarosix MC90-NTA Ni，Agarosix MC90-Ni Excel
阳离子交流层析：Agarosix-SP Excel，Monomix HC60-SP
复合阳离子交流层析：Agarosix MC75/45-MMC
疏水层析：Generik MC60/30-HIC Butyl，Polar MC60/30-HIC Phenyl
哺乳动物细胞表达体系
哺乳动物细胞全长表达（非全长可参考酵母体系）：通例的全长表达纯化工艺可参考酵母体系的纯化工艺（MMC+HIC模式），但由于胶原卵白长度很是长（资料显示通常三螺旋全长在200-300 nm），很难进入层析介质微球的孔里，因此可接纳非通例模式去进行层析：
1. 接纳核壳结构复合模式的层析填料，如PA团体官方网站的Monomix Core 500层析介质，其以高聚物为基球，孔径很是均一，外壳接纳特殊处置惩罚反面样品吸附，内核拥有疏水氨基的配体，可以在特定条件下将进入孔的分子量相对较小的HCP及片段吸附，全长的胶原流穿从而到达疏散效果。
2. 实验使用离子交流的流穿模式，由于胶原卵白很难进入层析填料的孔里，其载量相对很低，因此pa团体中国可以实验上较高的载量，使杂质卵白结合在填料上，由于上样载量高，结合在填料上的比例相对较低，也可以有不错的接纳率。
推荐填料：
核壳复合模式：Monomix Core 500
阳离子交流层析：Agarosix-SP Excel，Monomix HC60-SP
复合阳离子交流层析：Agarosix MC75/45-MMC
常见问题解答（FAQ）
胶原卵白类型众多，差异表达体系、差异功效区域片段都有较大的性质差异，下游纯化历程中如果有某些特殊分子还需要做相应调整。经过实际经验积累，PA团体官方网站总结了重组胶原卵白纯化的一些常见问题，为下游工艺优化提供解决方案。
Q1·胶原卵白在下罐以后，发生比力严重的降解，可能的原因及解决要领？
有可能是因为存在卵白酶水解位点，可以在下罐以后接纳高温孵育法灭火卵白酶，以及在发酵上清加入低浓度的EDTA。
Q2·胶原卵白色素去除困难，选哪种层析要领？
发酵色素类型较多，通例的类型有金属离子，糖类，糖卵白类等，纯阳离子交流很难去除的比力彻底，通�？梢允褂么惺杷灾实�复合离子交流层析MMC填料（Agarosix MC75/45-MMC）或者使用疏水层析色素去除效果会比力好。
Q3·阳离子或MMC层析在某些项目工艺复现欠好，应该怎么办？
由于胶原卵白的特殊结构，其长度较长可能存在卵白在填料上占用配位点不均一的情况，因此需要严格控制各组分Buffer的电导和pH（pH计和电导仪也需要经常校准）。
Q4·如何进行内毒素去除？
由于三类医疗器械要求对内毒素比力高，通常需要做到0.01 EU/mg以下，通例pa团体中国可以选择配基密度较高的强阴离子交流层析介质（Monomix Mab60-Q）。纯化条件pa团体中国尽可能选择较高的pH和较低的电导（pH需要低于样品pI防止样品结合，另外有些样品高pH不稳定，可在去除效果和稳定性平衡选择较好的pH条件）。
Q5·酵母发酵体系的层析前处置惩罚需要超滤换液或稀释降低电导，层析要领如何�。�
某些样品可以接纳离子交流复合疏水模式的MMC填料（Agarosix MC75/45-MMC）在不降低电导的情况下，直接进行上样捕捉，载量也不受影响。
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重组胶原卵白纯化“明星产物”—Agarosix MC75/45-MMC
重组胶原卵白纯化解决方案
推荐填料及订购信息
注：包装规格为1L，5 L, 10 L, 50 L，预装柱规格为1 mL, 4.2 mL, 5 mL
