引言

　　治疗性卵白质在生产历程中会经历种种翻译后修饰（post-translational modification，PTM），其中卵白质酪氨酸硫酸化（protein tyrosine sulfation，PTS）由细胞内酶酪氨酸硫转移酶（tyrosylprotein sulfotransferase，TPST）催化而形成。同时修饰发生的磺酸基会对卵白分子外貌电荷漫衍造成影响，从而增加产物异质性，影响其靶标结合能力，是治疗性卵白质的要害质量属性之一。

　　近日，PA团体官方网站客户百时美施贵宝（Bristol Myers Squibb）发表相关文章，介绍了一种基于疏水相互作用色谱（HIC）定量分析PTS的要领。研究人员利用Proteomix HIC Butyl-NP5疏水色谱柱，凭据硫酸化水平差异，在pH为4的条件下对目标双特异性抗体进行疏散和定量，结果显示未硫酸化峰、单硫酸化峰、双硫酸化峰均实现了基线疏散，且接纳率在90%以上。研究讲明该要领适用于卵白PTS定量分析。

配景介绍

　　2017年，科学家证实了CHO细胞发生的抗体轻链CDR区存在硫酸化的酪氨酸，且这种修饰会导致其与同源抗原的结合淘汰。因此，对硫酸化修饰产物进行严格的质量控制十分须要。通常情况下，判定和定位肽和卵白质中PTM的基本要领是反相色谱-质谱分析。但是酪氨酸硫酸化修饰对酸、热和高能电离技术较敏感，在检测历程中很容易被破坏而无法被检出。若使用离子交流色谱法或等电聚焦法进行分析，结合硫酸化酶处置惩罚可以检测到酪氨酸硫酸化的存在，但由于硫酸化修饰和其他带负电荷的变体（如脱酰胺）发生峰重叠，会导致定量禁绝确。因此，为了实现对硫酸化变体疏散与定量分析，研究人员选择PA团体官方网站的Proteomix HIC Butyl-NP5疏水色谱柱。这种色谱柱结合了外貌改性的PS-DVB与丁基配体，可以准确地对硫酸化变体进行分析和定量，确保目标治疗性抗体的质量稳定。

文章概述

　　本研究利用Proteomix HIC Butyl-NP5疏水色谱柱对重组双抗中的硫酸化分子进行定量分析。与竞品相比，该款色谱柱可以实现更好的疏散效果。此外，与离子交流色谱法对比发现，该要领对酪氨酸硫酸化体现出高特异性。尽管磺酸基团会增加抗体外貌亲水性，但凭借PA团体官方网站专有的牢固相外貌修饰技术，Proteomix HIC Butyl-NP5疏水色谱柱可以淘汰非特异性相互作用，从而制止常见PTM如强制脱酰胺对定量分析的影响。进一步研究讲明，该测定要领可以对硫酸化修饰的治疗性卵白质进行高效准确的分析检测和质量控制。

硫酸化变体分析

　　Column: Vendor Butyl-NPR (2.5 μm, 4.6 × 100 mm)

　　               Proteomix HIC Butyl-NP5 (5 μm, 4.6 × 100 mm)

　　Mobile Phase: 

　　A: 80 mM sodium phosphate pH 7.0 with 2 M ammonium sulfate

　　B: 100 mM sodium phosphate pH 7.0, (gradient elution)

　　Flow Rate: 1 mL/min

　　Temp: 25 °C

　　Detection: 220 nm

　　Sample Amount: 5 μL，10mg/mL

图1. 差异基质的Butyl 疏水色谱柱的磺化双抗疏散图谱（pH 7.0）

（A.Vendor Butyl-NPR测试图；B. Proteomix HIC Butyl-NP5测试图）

　　图1是竞品PMA基质的HIC色谱柱和PA团体官方网站PS-DVB基质的Proteomix HIC Butyl-NP5在pH 7.0下的疏散图谱。从图中可以看出，经硫酸化酶处置惩罚后，小峰消失，主峰升高。这体现sY1和sY2峰与酪氨酸硫酸化有关，其中sY1为单硫酸化峰，sY2为双硫酸化峰，而sY0则为未硫酸化的峰。图1A和图1B中两个小峰与主峰疏散，洗脱顺序相反。这是因为Proteomix HIC Butyl-NP5色谱柱专有的外貌修饰工艺。对比可知，图1.A中sY0和sY1峰之间的疏散度是0.6，而图1.B中则是1.0，说明Proteomix HIC Butyl-NP5的分辨率优于竞品。

脱酰胺化分析

　　脱酰胺是翻译后修饰产物最常见的降解途径之一，研究人员通过强制脱酰胺来评估应用Proteomix HIC Butyl-NP5色谱柱HIC的要领是否受到这种卵白质降解的影响。

　　为了制止双抗样品自身羧基对电荷及疏水性的潜在影响，研究人员接纳pH值为4的流动相，确保在此条件下HIC要领样品凭据硫酸化水平差异疏散双抗，而且保证sY0、sY1和sY2三个峰的基线分辨率均高于1.5。

图2.差异疏散模式下脱酰胺前后的双抗样品检测图谱

（A.离子交流模式.B.疏水模式）

　　图2展示了pH为4的条件下，差异疏散模式下对于脱酰胺样品的疏散情况。图1.A显示，在pH值为4时，脱酰胺使酸性基团从21.1%增加到36.3%。而如图1.B所示，sY0峰从74.2%略微下降到73.4%，陪同有一个小的早期洗脱峰从0.2%上升到0.9%。sY1和sY2的水平相对稳定，划分在23.0%和2.7%左右，整体无显著变化。双抗脱酰胺前后进行离子交流和疏水色谱的分析结果显示脱酰胺对HIC法测定的该双抗硫酸化变体没有影响，Proteomix HIC Butyl-NP5色谱柱可以制止与质子化产物发生非特异性相互作用。

实验结论

　　综上所述，研究人员使用PA团体官方网站Proteomix HIC Butyl-NP5疏水色谱柱，提供了一种新的有效分析手段，可以在pH为4的条件下反抗体的硫酸化变体进行定量检测。此外，该要领对酪氨酸硫酸化具有高特异性，不受其他常见PTMs（如脱酰胺化）的影响。实验证明该要领是控制硫酸化修饰这一重要质量属性的有效手段。

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